近日，深圳大学医学光子学创新研究院超分辨成像团队取得重要进展，相关研究成果发表于国际权威期刊《Analytical Chemistry》(JCR一区TOP，IF=6.7)。
团队创新研发多焦点像素/光子重分配超分辨荧光寿命显微成像技术(MPPR-FLIM)，融合图像扫描显微(ISM)超分辨方法与时间相关单光子计数(TCSPC)荧光寿命检测技术，有效突破传统荧光寿命显微成像(FLIM)的空间分辨率瓶颈，为亚细胞尺度微环境的精准表征提供了全新技术方案。
林丹樱教授为论文通讯作者，其指导的硕士研究生廖永图为第一作者，屈军乐教授、于斌教授等为共同作者，深圳大学为独立完成单位。
1. 研究背景
细胞器的生理状态直接决定细胞代谢与信号传导，线粒体、溶酶体等细胞器功能紊乱，是神经退行性疾病、肿瘤等重大疾病的重要诱因。而细胞器内部微环境并非均匀一致，存在明显空间异质性，想要深入探究其生理功能，就必须实现亚细胞尺度的高精度成像与定量分析。
FLIM是生物成像领域的重要技术之一，具备特异性强、灵敏度高、定量分析能力突出等优势，其中TCSPC-FLIM因检测精度高、动态范围广、适合多组分分析被广泛应用；但受光学衍射极限限制，难以分辨细胞器精细结构与局部寿命差异。
现有基于TCSPC的超分辨FLIM方案大多依赖高端定制器件，难以大规模推广应用。研发一款高性能、易普及的超分辨FLIM技术，具备较高的实用价值。
2. 技术创新
针对现有技术难点，团队研发了全新MPPR-FLIM成像技术和系统（图1）。
图1 MPPR-FLIM成像系统架构
该技术依托常规电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、光电倍增管(PMT)和TCSPC模块，搭配声光偏转器(AOD)实现多焦点并行激发与高速扫描，通过像素重分配和光子重分配算法完成图像重构，在无需高端定制硬件的前提下，实现超分辨荧光寿命成像，同时兼顾分辨率与测量精度(图2)。
图2 像素/光子重分配算法解析
3. 验证与应用成果
理论仿真与标准样品实验证明，相较于传统衍射受限FLIM成像，MPPR−FLIM可将空间分辨率从396 nm提升至184 nm，从而精准区分衍射极限范围内相邻微观结构的荧光寿命差异，充分验证了技术的稳定性和可靠性(图3)。
图3 超分辨寿命成像性能验证
团队将该技术应用于活细胞溶酶体观测(图4)：新技术可清晰分辨粘连的溶酶体结构，抑制信号混叠，捕捉到传统FLIM无法观测的溶酶体中空结构。实验还进一步发现，单个溶酶体内部荧光寿命分布不均，直观揭示其酸性微环境的空间异质性。该成果充分体现了本技术在亚细胞观测领域的巨大潜力，也为探究细胞器功能、解析疾病作用机制提供了有力工具。
图4 活细胞溶酶体pH异质性检测
4.研究总结
本工作提出的MPPR-FLIM技术，兼容常规商用光学器件，无需高端定制硬件，即可实现超高空间分辨率且高精度的荧光寿命检测，为细胞生物学、生物医学、疾病机制研究提供了一种实用的新型分析工具，应用前景广阔。
项目支持
本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和广东省基础与应用基础研究基金等项目的资助。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07992
