导读
近日，深圳大学医学光子学创新研究院在大视场荧光寿命成像（FLIM）与无标记病理组织分析方面取得重要进展，相关研究成果发表于国际期刊《Chemical & Biomedical Imaging》（JCR一区，IF=6.7）。
针对高分辨率FLIM成像视场有限、传统图像拼接方法难以兼顾组织连续性与荧光寿命一致性等问题，团队研发了一种面向大视场FLIM的高保真图像拼接方法（FLIStitcher）。该方法综合运用暗角与亮度校正、基于特征拼接的图像块对齐、相位相关的图像带对齐以及最小色差融合等策略，在无需额外改造显微成像硬件的情况下，实现多个高分辨率FLIM子视场的自动拼接与大视场寿命重建，为异质性病理组织的大尺度荧光寿命表征提供了一种新的技术方案。
博士研究生真鑫为第一作者，林方睿副研究员为论文通讯作者，福建省肿瘤医院邱素芳主任与福建医科大学第一附属医院的专家对本项研究给予专业指导，深圳大学为第一完成单位。
1. 研究背景
FLIM 凭借其对荧光寿命信息的定量表征能力，在病理样本无标记分析中具有独特优势。然而，病理切片中的异质性病变通常分布于毫米尺度范围，受光学显微系统空间带宽积限制，FLIM单次采集只能覆盖较小视场，难以同时兼顾高分辨率与大视野组织表征，进而影响病理区域分析、统计评估及组织学关联研究。虽然大视场物镜、自适应光学等硬件方案可以在一定程度上扩大成像范围，但其较高的系统复杂度和成本，限制了在常规FLIM 平台中的普适性。
相比之下，图像拼接提供了一种无需改变硬件结构的计算成像路径，通过整合多个具有重叠区域的高分辨率 FLIM 子图实现大视场图像重建。然而，现有拼接方法主要关注空间配准和强度层面的视觉融合，难以保证拼接过程中荧光寿命信息的准确性和一致性。拼接过程中的配准误差、光照不均、光子统计波动以及寿命拟合差异均可能导致寿命图出现不连续现象，仅依赖强度信息的融合策略也难以保证不同视场间寿命信息的一致性。
2. 技术创新
针对上述问题，团队研发了FLIStitcher：该方法可在保证完整视场寿命与颜色映射一致的前提下，重建荧光寿命图像。FLIStitcher集成了自动对齐、重叠区域一致性评估以及最小色差融合技术，有效减少拼接伪影。在无需额外硬件改装的条件下实现大视场高分辨率荧光寿命测量，为组织定量分析提供了实用的计算工具(图1)。
图1 FLIStitcher大视场荧光寿命图像拼接工作流程
3. 验证与应用成果
为了系统验证FLIStitcher的性能，研究团队分别从暗角校正、亮度一致性、拼接性能以及病理组织应用等方面开展实验评估。首先，FLIStitcher采用暗角校正解决子视场内亮度不均匀的问题，这是大视场FLIM拼接中伪影的主要来源。为了定量评估阴影校正效果，利用多种组织的FLIM图像进行模拟验证(图2)。所有组织类型的结构相似性指数（SSIM）平均值均保持在0.98以上，峰值信噪比（PSNR）平均值约为30 dB，表明了FLIStitcher能有效去除暗角，同时保留生物组织的精细结构。
图2 暗角校正在不影响组织结构的前提下改善视场均匀性
其次，FLIStitcher亮度校正旨在图像拼接前对子视场进行亮度一致性优化。图3展示了全局与局部亮度校正的综合效果。与未校正的结果相比，校正后的图像在整个视场范围内亮度一致性得到改善，同时局部结构细节仍清晰可见。
图3 亮度校正提升不同区域和同一区域内的亮度一致性
为了进一步评价FLIStitcher在复杂组织中的拼接性能，研究团队以肠组织切片为例，将其与Stitching、MosaicJ和SIFT方法进行了对比（图4）。结果显示，FLIStitcher 能够实现更加完整和连续的大视场组织重建。在保持组织形态和寿命对比的同时，FLIStitcher有效降低拼接错位、边界伪影以及亮度不一致等问题，体现出其在复杂病理组织 FLIM 数据重建的优势。
图4 FLIStitcher与现有拼接方法在大视场FLIM重建中的性能比较
最后，利用 FLIStitcher 将多个小视场 FLIM 子图重建为大视场全景寿命图像（图5），实现了基于平均寿命特征的无标记肿瘤区域识别。分类结果与相邻切片的 H&E 染色结果保持一致，进一步验证了拼接结果的连续性与可靠性。通过寿命分布直方图分析不同组织成分间的寿命差异发现，富含红细胞区域相比周围肿瘤组织具有更短的寿命分布，其峰值寿命分别约为 0.44 ns 和 0.86 ns。肿瘤相关区域相比间质区域同样表现出更短的寿命特征，其峰值寿命分别约为 1.05 ns 和 1.29 ns。上述结果表明，在保持组织结构和寿命信息一致性的基础上，基于FLIStitcher技术的大视场 FLIM 成像能够实现病理组织异质性的无标记表征，并展现出辅助病理分析的应用潜力。
图5 基于FLIStitcher的大视场肿瘤边界识别—卵巢癌切片
4. 研究总结
本研究提出了一种面向大视场荧光寿命显微成像的自动化高保真拼接方法——FLIStitcher。该方法通过整合图像校正、两级空间配准以及最小色差融合策略，将连续采集的高分辨率 FLIM 子图重建为大视场寿命图像。通过暗角校正和亮度校正，FLIStitcher有效改善了不同视场之间的强度差异。基于参考图像验证、大视场组织切片重建以及与现有拼接方法的对比分析表明，FLIStitcher能够减少拼接边界伪影，提高重建图像的结构连续性和寿命信息一致性。在大视场 FLIM 分析中展示了其在病理组织切片寿命表征的应用潜力。综上，FLIStitcher为将高分辨率 FLIM 从局部区域测量拓展至大尺度组织分析提供了一种有效的计算方法，并有望推动其在病理分析和生物医学成像中的应用。
项目支持
本研究得到深圳医学专项研究基金、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金、深圳市光子学与生物光子学重点实验室项目和生物医学光学微纳检测与成像重点实验室，以及深圳大学科研团队培养计划项目资助。
原文链接：https://doi.org/10.1021/cbmi.6c00164
