导读
近日，深圳大学医学光子学创新研究院在应用物理领域权威期刊《Applied Physics Reviews》(JCR一区TOP期刊)发表题为“Applications of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Brain Disease Research: A Comprehensive Review”的综述论文。
该综述系统总结了荧光寿命成像显微镜(FLIM)在脑疾病研究中的最新进展，涵盖神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症)和脑肿瘤(胶质瘤、脑膜瘤、转移瘤)两大领域。文章从FLIM的基本原理与检测方法出发，重点阐述了FLIM在无标记代谢成像、蛋白质聚集检测、术中肿瘤边界识别及疗效评估等方面的独特优势，并展望了该技术向临床转化的关键路径。博士研究生易敏为该论文的第一作者，屈军乐教授、林方睿副研究员为该论文的通讯作者，深圳大学为第一完成单位。
1. 领域发展概述
神经退行性疾病和脑肿瘤是最常见且危及生命的脑疾病之一。世界卫生组织预测，到2040年神经退行性疾病将超过癌症，成为全球第二大死亡原因。传统影像手段如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和正电子发射断层成像(PET)虽能实现体内结构和分子过程的可视化，但其空间分辨率局限于毫米尺度，无法解析神经血管单元和细胞网络的精细微结构。光学显微镜虽提供纳米级分辨率作为补充，但传统荧光成像依赖强度读数，易受光漂白、激发功率波动和荧光团分布不均影响，难以量化微环境中细微但有生理意义的改变。因此，亟需一种兼具高空间分辨率、定量能力和活体适用性的成像工具，用于揭示脑疾病的分子病理机制并指导临床诊疗。
2. 核心技术
FLIM通过测量荧光分子被激发后返回基态的平均时间(即荧光寿命τ)来获取图像对比度。荧光寿命是荧光团的内在属性，对pH值、离子浓度、分子结合状态等微环境变化高度敏感，且测量结果不受荧光团浓度和激发功率波动的影响。综述详细介绍了时域(TD-FLIM)和频域(FD-FLIM)两大技术路线：TD-FLIM采用脉冲激光激发，通过时间相关单光子计数(TCSPC)、门控检测或条纹相机记录荧光衰减曲线，具有皮秒级时间精度和单光子灵敏度，适合解析复杂多指数衰减过程；FD-FLIM采用强度调制激发光，通过测量相位延迟和调制比来推算寿命，可实现宽场并行检测，成像速度快、光毒性低。在数据分析方面，综述归纳了曲线拟合、相量分析、Laguerre反卷积和机器学习四种主流策略，其中相量分析无需迭代拟合即可实现近实时寿命提取，而深度学习模型在低光子计数条件下仍能保持较高的估算精度。
3. 应用结果
一、在神经退行性疾病研究中，FLIM从三个层面揭示了病理机制(图1)。
1.蛋白质聚集检测：FRET-FLIM实现了α-突触核蛋白N端/C端分子内和分子间相互作用的活细胞检测，发现了可调控的亚稳定构象；针对TDP-43的FLIM-FRET定量评估了C端结构域寡聚体的结构紧密度及PROTAC药物的干预效果；极性敏感探针(如h-FTAA、Agg-Pro)结合FLIM揭示了Aβ斑块和SOD1聚集体微环境的极性变化。
2.线粒体代谢评估：NAD(P)H-FLIM通过区分自由态(~0.4 ns)和蛋白结合态(1-5 ns)NAD(P)H的荧光寿命，无标记地表征了阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)模型中一致的代谢功能障碍特征——病理状态下蛋白结合态NAD(P)H寿命显著降低，反映线粒体呼吸链活性受抑。该技术还发现了神经元胞体与树突之间的代谢异质性，并验证了环姜黄素等神经保护剂的疗效。
3.金属离子稳态：基于FLIM的离子敏感探针(OGB-1、NRA、NRNM)实现了AD模型中Ca²⁺、Fe³⁺和Cu⁺的亚细胞分辨率动态分布成像，揭示了金属离子在AD不同脑区和病程阶段的时空演变规律。
图1 综述内容框架
二、在脑肿瘤研究中，FLIM展现出从基础研究到临床转化的完整路径。
1.术中边界识别：FLIM已集成至手术显微镜和手持光纤探头，基于5-ALA诱导的PpIX-FLIM或ICG-FLIM，在离体样本和术中实时条件下准确区分肿瘤与正常脑组织。多光谱时间分辨荧光光谱系统(ms-TRFS)在数秒内采集四个光谱波段的衰减曲线，实现了IDH突变型少突胶质细胞瘤与星形细胞瘤的准确鉴别(ROC-AUC=0.92)，并可区分不同肿瘤细胞密度和原发/复发性胶质母细胞瘤。
2.无标记代谢成像：基于NAD(P)H和FAD内源性荧光团，FLIM无需外源染料即可评估胶质瘤、脑膜瘤和转移瘤的代谢状态。研究显示，肿瘤组织的平均荧光寿命和自由/结合态NAD(P)H比例与正常组织存在显著差异，且随恶性程度呈梯度变化。
3.治疗疗效评估：NAD(P)H-FLIM在患者来源的胶质瘤细胞和3D类器官模型中实时监测了替莫唑胺、瑞戈非尼和免疫检查点抑制剂(抗CTLA-4)的治疗响应，发现了响应组与非响应组之间明显的代谢特征差异，为个性化治疗提供了快速评估手段。此外，FLIM通过监测光敏剂(金丝桃素、维替泊芬)的单体/聚集态比例，优化了光动力治疗的给药方案。
4. 总结与展望
本综述系统梳理了FLIM在脑疾病研究中的原理、方法和应用全景，得出以下核心结论：
(1)FLIM通过荧光寿命这一浓度无关的定量参数，为脑疾病研究提供了从分子事件到组织病理的多尺度成像桥梁；
(2)在神经退行性疾病中，NAD(P)H-FLIM和FRET-FLIM分别从代谢和蛋白质互作两个维度揭示了AD、PD和ALS共有的病理机制，并验证了多种干预策略的有效性；
(3)在脑肿瘤中，FLIM已成功实现从离体验证到术中实时导航的跨越，在边界识别、分子分型和疗效评估方面展现出独特的临床价值。
综述同时指出，成像深度受限、信号解译复杂、NIR-II区探针短缺及临床标准化缺失仍是制约FLIM广泛临床转化的主要瓶颈。未来，需在NIR-II窗口深层成像、物理信息驱动神经网络、标准化共享数据库建设和多模态融合成像等方面持续推进，使FLIM真正成为脑疾病早期筛查、精准诊断和疗效追踪的常规工具（图2）。
项目支持
该工作得到了深圳大学研究团队培育计划、深圳市医学研究专项、国家自然科学基金以及深圳市光子学与生物光子学重点实验室的支持。
原文链接：https://doi.org/10.1063/5.0337865
