导读
近日，深圳大学医学光子学创新研究院超分辨成像团队在超分辨荧光显微成像领域取得重要进展，相关研究成果发表于光学经典学术期刊《Optics Letters》。
团队创新研发了一种基于贝塞尔光束的高精度荧光调制超分辨成像技术(HPFM)，通过引入一阶贝塞尔空心光束替代传统的环形光束，显著改善实心与空心激发点扩散函数(PSF)的匹配度，有效抑制荧光差分类型成像技术中固有的差分伪影，在低激发功率下实现约λ/4~λ/6的横向分辨率，为活细胞长时程动态观测提供了更为稳健、实用的超分辨工具。
硕士研究生刘东一和博士研究生易敏为本论文的共同第一作者，屈军乐教授和王璐玮助理教授为共同通讯作者，深圳大学为独立完成单位。
1. 研究背景
光学衍射极限将传统荧光显微镜的分辨率限制在约200 nm。过去三十年间，各类超分辨技术应运而生，如受激发射损耗(STED)显微镜、结构光照明显微镜(SIM)、单分子定位显微镜(PALM/STORM)等。然而，这些方法往往受限于复杂的光学系统、高昂的成本或严苛的样品制备要求等瓶颈。
荧光差分显微镜因光路简洁、光毒性低而备受关注。其工作原理是依次以实心光斑和空心光斑对样品进行扫描，再通过两帧图像相减实现PSF压缩。相较于STED，该方法所需的激发功率大幅降低，对活细胞成像尤为友好。然而，该技术面临一个根本性难题：实心与空心PSF难以实现完美匹配，差分处理后往往产生显著的负旁瓣，进而引入图像畸变、伪影，甚至造成生物样品信息丢失。因此，如何在不过度增加系统复杂度的前提下，提高PSF匹配精度并有效抑制伪影，成为该领域亟待突破的关键问题。
2. 技术创新
针对上述难题，团队引入一阶贝塞尔光束，研发了HPFM成像技术及系统(图1)。与传统0–2π涡旋相位调制的环形光束相比，贝塞尔光束具备更小的暗核尺寸和可调谐的环状结构，其复振幅由涡旋相位项与贝塞尔函数共同决定。通过空间光调制器(SLM)加载集成的轴锥–涡旋相位掩模，可连续调控径向波矢，进而精确调节空心焦斑的环半径，实现实心与空心PSF的最佳匹配。
HPFM系统光路与共聚焦显微镜高度兼容，仅需切换SLM加载的相位图，即可在共聚焦模式与HPFM模式间灵活切换。系统采用488 nm连续激光作为激发源，配合振镜扫描、针孔滤波及APD探测，结构紧凑且易于复现。最终图像由共聚焦图像与贝塞尔空心图像按优化系数相减获得。此外，贝塞尔光束的无衍射自愈特性，赋予该方法在深层组织成像中的潜在优势。
图1 HPFM系统原理图及工作原理
3. 验证与应用成果
团队首先以直径23 nm荧光珠为样品进行成像验证。统计结果显示，HPFM的平均横向分辨率(单个荧光珠像斑的半高全宽)达114.9 nm，优于共聚焦(194.7 nm)和传统荧光差分显微镜(FED，127.2 nm)。去相关分析进一步验证了分辨率提升的可靠性(图2)。
图2 基于荧光珠样品的分辨率表征
在固定细胞成像中，HPFM清晰解析了U2OS细胞微丝和小鼠BAPE细胞微管蛋白的精细结构，而共聚焦及传统FED图像则出现模糊或粘连(图3)。强度剖面与半高全宽统计表明，HPFM在对比度和边缘锐度上均优于对照方法，且结果波动更小，重复性优异。
图3 固定细胞(微丝、微管蛋白)的HPFM超分辨成像对比验证
活细胞成像实验中，团队采用MitoTracker Green FM标记活体BSC细胞线粒体，在仅26 μW的激发功率下，HPFM以约100 nm分辨率对线粒体动态进行了长达3.5 min连续观测，清晰捕捉到两个相邻线粒体接近、接触并融合的全过程(图4)。每帧HPFM图像采集仅需3.0 s(共聚焦1.5 s+贝塞尔图1.5 s)，光漂白与光毒性极低，充分展示了该方法在长时程活细胞动态研究中的实用潜力。
图4 活细胞线粒体的HPFM超分辨动态成像
4. 研究总结
本工作提出的HPFM技术，充分发掘一阶贝塞尔光束在空心聚焦方面的结构优势，有效抑制了差分类超分辨成像中PSF失配带来的伪影问题，实现了低光毒、高保真的超分辨成像。该方法与常规共聚焦系统高度兼容，适配Alexa Fluor 488、MitoTracker Green等常见荧光染料，操作简便、稳定性强，为亚细胞结构动态观测及复杂生命过程研究提供了一套易于推广、切实可用的新工具。
项目支持
本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和广东省基础与应用基础研究基金等项目的资助。
原文链接：https://doi.org/10.1364/OL.607170
