导读
近日，深圳大学医学光子学创新研究院在脂滴微环境定量成像与氧化应激研究方面取得新进展，相关研究成果发表于国际分析化学领域权威期刊《Analytical Chemistry》(JCR一区TOP，IF=6.7)。
研究团队开发了一种脂滴靶向荧光寿命探针LDP-Pol，并通过多尺度实验验证其对脂滴局部极性的定量检测能力。研究发现，氧化应激和铜处理均可引起脂滴局部极性升高，且不同细胞乃至同一细胞内不同脂滴之间呈现出显著的响应异质性。该研究为解析铜诱导氧化与代谢应激过程中的脂质重塑提供了新的成像工具。
黄振龙副研究员、林方睿副研究员为论文通讯作者，博士研究生王义强为第一作者，深圳大学为第一完成单位。
1. 研究背景
脂滴曾被视为储存甘油三酯和胆固醇酯的惰性“脂质仓库”，近年来研究发现，脂滴实际上是一类高度动态的细胞器，不仅参与连接脂质转运，还与膜稳态、细胞器通讯和应激适应的重要动态细胞器。当细胞氧化还原平衡被打破时，脂滴既可以暂时收纳脂毒性分子、缓冲氧化损伤，也会因脂质氧化、堆积状态改变以及细胞器间物质交换而发生微环境重塑。
铜是维持细胞生命活动所必需的微量元素，但过量铜会扰乱氧化还原稳态和线粒体代谢，并可能触发包括铜死亡在内的多种细胞损伤过程。已有研究较为深入地描述了铜过载条件下线粒体代谢异常、脂酰化三羧酸循环蛋白聚集和铁硫簇蛋白失稳等事件，但脂滴如何响应铜诱导的氧化和代谢扰动，以及内部微环境如何发生变化，仍缺少能够在活细胞中进行连续、定量观察的方法。
传统脂质分析方法多依赖总体样品、终点检测或荧光强度。总体和终点检测难以保留单个细胞及局部脂滴之间的空间差异，而荧光强度又容易受到探针装载量、激发功率、光漂白以及组织吸收和散射等因素影响。荧光寿命反映分子激发态的衰减动力学，对探针浓度和照明波动相对不敏感，因此更适合把复杂生物样品中的微环境变化转化为可比较的定量参数。
2. 技术创新
围绕脂滴微环境的定量检测需求，研究团队设计了极性响应型荧光寿命探针LDP-Pol：该分子以三苯胺和BODIPY构成极性响应单元，并引入受内源脂质组分启发的C12甲酯链，使探针更适配富含甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质的脂滴核心。对照实验显示，无酯C12类似物虽可依靠疏水作用进入脂质区域，但脂滴与胞质的信号比明显低于LDP-Pol，表明甲酯链不仅提供疏水性，也有助于探针向脂滴中性脂质环境选择性分配。在分析策略方面，研究团队通过双指数拟合将荧光寿命衰减曲线分解为短寿命和长寿命组分，并以二者幅度比a₁/a₂分析脂滴内部不同极性微区的相对变化；相比仅采用平均荧光寿命表征脂滴整体状态，该方法既能反映脂滴平均极性的变化，也可揭示高极性区域比例增加和微环境异质性增强等细节，为解析氧化应激和铜处理下的脂滴重塑提供了新的数据处理维度。(图1)
图1 LDP-Pol的分子设计、极性响应机制与脂滴靶向策略
3. 验证与应用成果
研究团队通过理论计算与光物理实验验证了LDP-Pol的响应机制，确认其荧光寿命主要受周围极性调控，而非分子扭转引起的随机淬灭。在不同极性溶剂中，探针的发射峰和荧光寿命均呈规律性变化，并在一定范围内与极性保持良好线性关系；在模拟脂滴的中性脂质体系中，LDP-Pol同样能够分辨由脂质组成和堆积状态差异引起的局部微环境变化。
在活细胞中，LDP-Pol与商业脂滴染料高度重合，Pearson相关系数达到0.98，且具有较好的细胞相容性。结合结构光照明显微成像，研究团队还动态观察并量化了脂滴与线粒体之间的接触过程，表明该探针不仅能够定位脂滴，也适用于研究脂滴参与的细胞器互作。(图2)
图2 LDP-Pol的脂滴定位性能及脂滴—线粒体动态接触成像
在过氧化氢和铜处理条件下，脂滴荧光寿命均明显缩短，提示局部极性升高。同时，铜处理还导致脂滴数量增加、面积扩大，并伴随脂质过氧化水平上升。研究结果表明，铜诱导的氧化与代谢应激会推动脂滴发生结构和微环境重塑。进一步在4T1肿瘤组织中进行双光子荧光寿命成像，也观察到类似变化，说明LDP-Pol可用于复杂组织中脂滴应激状态的定量分析。(图3，4) 
图3 铜处理引起的脂滴形态变化、局部极性升高及脂质过氧化
图4 LDP-Pol在小鼠皮下4T1肿瘤中的双光子荧光寿命成像
4. 研究总结
该研究构建了从分子设计、理论计算和溶液标定，到脂质模拟体系、活细胞成像及动物组织验证的完整证据链，开发的LDP-Pol探针集脂滴靶向、近红外发射、双光子激发和极性依赖荧光寿命响应于一体，可定量比较不同尺度下脂滴微环境变化。研究发现，氧化应激和铜处理均会提高脂滴局部极性，并伴随脂滴数量、面积、脂质过氧化水平及寿命组分比例变化，表明脂滴是参与脂质缓冲、氧化损伤响应和代谢重塑的动态细胞器。需要指出的是，LDP-Pol并不直接识别铜离子或铜死亡特异性事件，其寿命变化反映的是铜诱导氧化与代谢应激下脂滴微环境的综合重塑；未来结合铜离子螯合、线粒体代谢、脂质组学及铜死亡标志物等分析，有望进一步拓展其在肿瘤代谢、神经退行性疾病和药物筛选中的应用。
项目支持
本研究得到国家自然科学基金项目(T2421003、62127819、62435011)、深圳市光子学与生物光子学重点实验室项目(ZDSYS20210623092006020)及生物医学光学微纳检测与成像重点实验室项目(ZDSY20130329101226215)等支持。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c03779
